Vissza a főoldalra
 
    Címlap
    Enciklopédia
    Ismerettár
    Hypermed
    Étrend
    Ép testben
    Hírarcívum
 
Hypermed - Klinikai szakteruletek -
Molekuláris biológia
Daganatpatológia- Mikrobiológiai kórokozók kimutatása molekuláris biológiai módszerekkel- Öröklődő kórképek- Vizsgálati módszerek

Ajánlási listák
Paraffinba ágyazott szövetekből mikrodisszekcióval nyert tumor sejtek amplifikációjára alkalmas PCR technika
A reliable PCR amplification metho for microdissected tumor cells from paraffin-embedded tissue
Biomol Eng 1999;15:229-33.

SZEMLÉZÉS
Készítette: dr. Patócs Attila , A Akalu , J K V Reichardt
A különbözőképpen fixált sejtekből történő DNS izolálás napjaink egyik legfontosabb molekuláris biológiai módszertani kérdése. A sejtek izolálásának és kinyerésének technikai fejlődése lehetővé teszi, hogy ezekből a sejtekből DNS-t izoláljunk. A tárgylemezekre kikent szövetmintákból az un. mikrodisszekciós technikával célzott sejteket tudunk leválasztani. Ezekből a sejtekből nyert DNS amplifikálásával a tumorokra illetve metasztázisokra jellemző szomatikus génrendellenességek célzottan vizsgálhatóak. A szerzők ebben a közleményben különböző DNS izolálási technikákat valamint különböző Taq polimerizációs enzimek hatékonyságát hasonlítják össze.
Vizsgálataikban a szteroid-5alfa-reduktáz enzim 2-es típusát kódoló gén prosztata carcinómában felvetődő lehetséges szerepét követték nyomon. A sejtekből nyert DNS izolálásához illetve tísztításához összehasonlították a QIAquick gélextrakciós kit (Qiagen) hatékonyságát a hagyományos fenol-kloroform extrakciót követő etanolos kicsapás hatékonyságával. Az izolált DNS PCR amplifikálásához használt Taq enzimek közül összehasonlították az AmpliTaq GOLD (Perkin-Elmer), PLATINUM Taq (Life Technologies) és Taq polymerase (Life Technologies) enzimek hatékonyságát.
A közleményben részletes módszertani leírásokban ismertetik a különböző izolációs technikákat. A formalin- illetve paraffinba ágyazott szövetből származó sejteket mikrodisszekcióval választották ki, majd a használt DNS kinyerési technikáktól függően izolálták a DNS-t. Eredményeik szerint a QIAquick gél-extrakciós kit segítségével izolált DNS mind mennyiségileg, mind pedig minőségileg jobb volt mint a hagyományos izolációs technikákkal nyert DNS. A hagyományos izolálás során a négy centrifugálást és legkevesebb két vortexelést kell elvégezni, ami elősegíti a fixált szövetből nyert DNS töredezését, ami nagy molekulasúlyú PCR termékek képzését nehezíti, olykor lehetetlenné teszi. Eredményeiket összesítve megállapították, hogy QIAquick gel etrakciós kit segítségével nyert DNS-t templátként használva a PCR reakciók 73 %-a volt sikeres, és 1 kb. nagyobb fragmenteket is sikerült amplifikálniuk, míg a hagyomáyos izolációval nyert DNS-t használva a PCR reakciók csak 23 %-a működött, a fragmentek pedig csak 300 bázispár hosszúak voltak.
Az amplifikációhoz használt enzimek vizsgálatával megállapították, hogy AmpliTaq GOLD enzimmel sikerült kivitelezni ezt a nagy fragmentet, illetve, hogy ezt az enzimet használva kisebb fragmensek előállításához a nyert termékek töménysége 6-10X volt a PLATINUM Taq és kb 20x az egyszerű Taq polymerase enzimmel nyert termékek koncentrációinak. Eredményeiket összesítve egyértelművé vállt, hogy az AmpliTaq GOLD enzimmel és a QIAquick gél-extrakciós kit segítségével paraffinba ágyazott sejtekből könnyen, gyorsan és nagy hatékonysággal lehet PCR fragmenteket amplifikálni. Az eredmények meggyőzőek, minden molekuláris biológiával foglalkozó szakember számára nagyon fontos alapkérdésekben segít választani ez a közlemény.

KOMMENTÁR
Egy olyan alap publikáció ez, amelyből minden klinikai genetikai, molekuláris biológiai laboratórium fontos információkat szerezhet. Napjainkban számtalan cég forgalmaz különböző "szuper" DNS izolációs illetve PCR-hez szükséges Taq polymerase enzimeket, melyek a mellékelt tájékoztatók alapján mind kivállóan müködnek és éppen a nekünk megfelelőek. A gyakorlatban természetesen nem egészen így van. Minden laboratóriumnak meg kell találnia a hozzá legmegfelelőbb vegyszereket és technikákat. Ennek a publikációnak a jelentősége abban van, hogy egy olyan összefoglálót tartalmaz, ami olyan DNS-t használ templátként, melynek kinyerése 10 évvel ezelőtt még szinte elképzelhetetlen volt. A cikkből nem csak a DNS izolálás csúcstechnikáját hanem az optimalizált PCR protokollt is megismerhetjük. Ez a közlemény csak egy a számtalan közül, ami segíthet munkánk elindításában, de természetesen más típusú vizsgálatokhoz más cégek más rendszerei is kiválóan működhetnek, de a fixált szöveből nyert DNS vizsgálatához ez egy meggyőző és biztos módszernek tűnik.

Irodalmi hivatkozások száma: 14
Ábrák száma: 2
Táblázatok száma: 3

Az oldalon olvasható információk nem helyettesíthetik a szakemberek véleményét, tanácsát, ezért kérjük ne kísérletezzen öngyógyítással, forduljon orvoshoz!
A gyógyszerekkel és gyógyhatású készítményekkel kapcsolatban a kockázatok és a mellékhatások tekintetében olvassa el a betegtájékoztatót, és kérdezze meg kezelőorvosát, gyógyszerészét.

Copyright2001-2002 Vitalitas.hu Kft.